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定点突变
点击次数:334 发布时间:2013-07-09
 

 概念 
  定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA,片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是基因研究工作中一种非常有用的手段。 
  体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能,二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构,对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系,探讨蛋白质的结构/结构域。而利用技术改造基因:比如野生型的绿色荧光蛋白(wtGFP)是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光,经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造,现在的GFP能在可见光的波长范围被激发(吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。技术的潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNA作用元件,提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构,以及药物研发、基因治疗等等方面。 
单点突变 
  对于单点突变,Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择,通过巧妙设计,将质粒技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物(正、反向),和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”,(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物,一圈后回到引物5’端终止,再经过反复加热褪火延伸的循环,这个反应区别于滚环扩增,不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物,由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌,是经dam甲基化修饰的,对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC,GATC在几乎各种质粒中都会出现,而且不止一次),而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开,因此在随后的转化中得以成功转化,即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感,利用酶切除去模版质粒,得到突变质粒,使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的zui好的高保真聚合酶之一,堪称高保真聚合酶的“黄金标准”,是Stratagene的看家之宝,能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR,有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化,实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质粒的的,通过优化试剂特别是其感受态细胞(XL10-Gold),使得较大的质粒的也一样简单。QuikChange由于操作简单快速,效率高( >80%)而受到普遍欢迎,光是今年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。 
  的比较有特色的产品还有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit,需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物(同一方向,对同一单链模版),一条包含计划的序列,另一条引物包含质粒上某一个单酶切位点,不过在单酶切位点中引入突变,这样两条引物除了所包含的突变位点,其他序列和质粒上对应位置的序列完全一致,退火后和质粒模版结合,通过T4 DNA聚合酶延伸,延伸反应持续直到碰到另一条引物停止,两段包含突变位点的延伸产物经T4连接成环,和模版链组成杂和环,带有两处错配。单酶切反应产物,直接转化Ecoli BMH 71-18 mutS(错配修复缺陷株)。原来的双链质粒模版被切开而不能转化,而杂和质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开,保持环状质粒得以转化。转化子的杂和双链在E.coli的复制过程中分开,再经过一轮提质粒、单酶切、转化,zui后得到纯和的突变质粒。这个试剂盒则是利用改造单酶切位点使得新合成的突变质粒不被切开从而除去原来的模版质粒。虽然这个试剂盒比上一个麻烦,但实际上是引入了两个。只不过一个用于酶切除掉模版的反应。 
多点突变 
  有的时候研究可能需要多个位点的,比如改造酶的活性或者动力学特性,研究蛋白之间的相互作用位点等,单点突变不能满足实验的需要,重复进行单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。zui多一次实验可以引入5个。这个试剂盒的原理和Clontech的相似,就是准备多个带突变的引物(同方向,对同一单链模版),退火后全部突变引物(不超过5个)都结合在同一环状单链模版,PfuTurbo聚合酶延伸,碰到下一个引物就停止,各片断经连接成环,和单链模版组成杂和环,DpnI消化双链模版,也消化杂和环中的模版,只留下新合成的带多个突变的单链环(mutant ssDNA),得以转化E.coli,形成双链质粒。资料表明,引入3个的效率为60%,5个的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少的质粒,以引入3个为例,就是有40% 左右的转化质粒是带有1—2个不同的质粒(因为存在1—2个引物结合模版延伸形成单链环的可能)。这样,一次实验可以得到不同数目突变的质粒,对于研究蛋白质结构和功能的关系也是有用的。 
  不同于的是基于PCR的随机突变,通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错,这种方法适用于未知的蛋白质,作全局性分析,所以有人称为饱和突变(saturation mutagenesis)。不过这种方法由于没有目的性,分析操作相当繁琐,并且不会出现一个位点2个以上碱基突变,因而应用上有局限性。适用于蛋白结构已有初步了解的基因,比PCR随机突变更有目的性,也更为,简单,同时改造基因更加“随心所欲”。由于技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景,相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展,也必将为更多人熟悉应用。 
[编辑本段]的意义 
  根据生物学理论知识,基因会发生突变,突变可以自发,也可以诱发。但在加拿大生物化学家M·史密斯(1932-2000年)发明法之前,突变株的产生必须经由自然界或用化学等方法诱使基因体突变。这类方法属于随机突变,突变株必须在生物形状上有所改变,才能确定有突变发生,但除非用分子生物方法或遗传方法找到此突变处,否则无法确定突变位置。也就是说,这种突变是盲目的。而史密斯发明的法却是有目的的,该法可经由设计好的寡核苷酸,在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变,也就是说,这种突变是预先设定好的,所以也有人将该法称为“反遗传法”。 
  有意思的是这一给生命科学研究及应用领域带来革命性突破的方法竟然是史密斯和其同事在喝咖啡时闲聊出来的。现在,几乎每个生物实验室都会用法来研究基因或蛋白质的功能。法的应用不仅广泛用于基因工程技术领域,还可用于农业培育抗虫、抗病的良种,用于医学矫正遗传病、治疗癌症等病。

 
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113209-90-8/4-氯-5-氟-2-吡啶甲醇
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