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反义RNA
点击次数:413 发布时间:2013-08-12
 

反义RNA-定义 
反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA,所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式,zui早是在E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的,许多实验证明在真核生物中也存在。近几年来通过人工合成的基因, 并将其导入细胞内转录成, 即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能, 有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也暗示了该方法对肿瘤实施基因治疗的可能性。 

-来源  
细胞中的来源有两种途径∶*是反向转录的产物,在多数情况下, 是特定靶基因互补链反向转录产物, 即产生mRNA和的DNA是同一区段的互补链。第二种来源是不同基因产物,如OMPF基因是大肠杆菌的膜蛋白基因,与透性有关,其反义基因MICFZE则为另一基因。
-分类 编辑本段回目录
的分类和作用机制:下表总结了原核细胞内天然存在的11种。这些按其作用机制可经分为三大类。
调节水平 靶RNA 分类 功能 来源 
转录后水平 micF RNA ompF mRNA 1A OmpF合成 染色体 
oop RNA cⅡmRNA 1B 溶菌-溶源 噬菌体 
sar RNA antmRNA 1A 溶菌-溶源 噬菌体 
ouT RNA 转位酶mRNA ⅠA 转位作用 转位子 
finp RNA traJ mRNA ⅠA DNA转位 
sok RNA hok mRNA ⅠA 杀死作用 
copA RNA repA mRNA Ⅱ 复制 质粒 
R1162RNA repⅠmRNA Ⅱ 复制 
pT181RNA repC mRNA Ⅱ 复制 
转录水平 ticRNA CAP mRNA Ⅲ cAMP结合蛋白 染色体 
复制前水平 RNAⅠ RNAⅡ Ⅲ DNA复制 质粒 
Ⅰ类:这类直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区,引起翻译的直接抑制(ⅠA类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加,使其降解(ⅠB类)。Ⅱ类:这类与mRNA的SD序列的上游非编码区结合,从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚,可能是与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变,因而阻止了核糖体的结合。Ⅲ类:这类可直接抑制靶mRNA的转录。
ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMP结合蛋白)的mRNA的。ticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活,从CAP mRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始,以CAP mRNA的模板DNA链的互补链为模板,合成ticRNA。ticRNA具体长度不清楚,但是它是5'端一段正好和CAP mRNA的5'端有不完全的互补,可以形成双链的RNA杂交体。而在CAP mRNA上紧随杂交区之后的是一段约长11bp的A,U丰富区。这样的结构十分类似于ρ不依赖性的转录终止子的结构,从而CAP mRNA的转录刚刚开始不久后即迅速终止。从这个例子中我们可以看到CAP蛋白合成的自我调节作用。当CAP合成达一定量后,即可与cAMP结合成cAMP-CAP复合物。再激活ticRNA的启动子转录出ticRNA,反过来抑制CAP-mRNA的合成。

-功能 
在原核生物中具有多种功能,例如调控质粒的复制及其接合转移,抑制某些转位因子的转位,对某些噬菌体溶菌-溶源状态的控制等。下文仅举数例。
1.调控细菌基因的表达:对编码CAP的基因的调控作用已如前述。这里再介绍一下micF RNA对ompF基因的表达的调控。ompF蛋白质是大肠杆菌的外膜蛋白的主要成分这一。micF RNA是从另一基因(ompC基因)附近的DNA序列转录而来,和o-mpFn RNA的5'端有70%的序列互补,因此在体外micF RNA可以抑制ompF mRNA的翻译。但是这种抑制作用在体内是否重要尚有疑问,因为缺失micF基因的菌株其ompF蛋白的表达只受到轻微的影响。
2.噬菌体溶菌/溶源状态的控制:也参与了λ和P22噬菌体的溶菌/溶源状态的控制。P22噬菌体编码一种抗阻遏蛋白Ant,它可以抑制许多λ样噬菌体的阻遏蛋白与DNA的结合。这对于刚刚感染细胞的P22建立λ样原噬菌体(prophage)是有益的。但是Ant必须在严格的控制下,否则Ant的过分表达必将阻止溶源状态的建立,而成为溶菌性的噬菌体。Ant蛋白质表达的控制是利用(sarRNA)能与ant mRNA的翻译起源区互补结合,从而抑制ant mRNA翻译成Ant蛋白。
在λ噬菌体中cⅡ蛋白控制着溶菌或溶源状态的选择。cⅡ蛋白可以激活λPre启动子,该启动子控制的基因是λ噬菌体整合作用所必须的,且同时能抑制λ噬菌体的复制。cⅡ蛋白的另一功能是延缓λ晚期基因的表达,其作用机制是cⅡ蛋白激活PaQ的启动子,转录出PaQRNA。PaQRA是编码Q蛋白的mRNA的。因此,PaQRNA能与QmRNA配对杂交而抑制其翻译,而Q蛋白早已知道是晚期基因表达的激活蛋白。
cⅡ基因本身的表达还受到称为oopRNA的的调控。oopRNA与cⅡ基因的3'端互补,但其具体作用机制尚不清楚。
3.IS10转位作用的抑制:outRNA是一种,可以和IS10编码的转位酶mRNA(INRNA)5'端结合而抑制其翻译,当细胞内只有一个考贝IS10时,只能生成很少量的outRNA,故转位酶仍可生成。但当IS10的考贝数增多时,outRNA愈来愈多,其控制作用亦明显增强,所以称为多考贝抑制现象。这种现象可以防止IS10的过量堆积引起的细胞损害。

-人工合成 
既然在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用,那末人工设计在天然状态下不存在的来调节靶基因的表达,想必也是可能的。这已在不少实验中得到证实。
1.由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少,因此,在要设计Ⅱ类用于和靶mRNASD序列上游区结合,以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。
2.Ⅲ类是和mRNA的起始处结合而形成类似ρ-不依赖性的转录终止子而使转录水平上抑制靶基因的表达。因此,要设法在靶mRNA上找到一段连续的U序列,就可以设计出,与该U序列上游的mRNA链互补,以形成ρ-不依赖性终止子。理想的作用位点是在靶mRNA的5'端上游的非编码区,以免受核糖体的影响。
3.只要靶基因的核苷酸顺序已经知道,就可以人工设计出Ⅰ类。有时还可设计同时具有Ⅰ类和Ⅲ类功能的。
我们还可以设计出天然存在的的来。这样就可以拮抗原始对靶mRNA的抑制作用。而达到激活或加强某个靶基因的表达的目的。然而并不是所有的mRNA对其相应的Ⅰ类都敏感。例如,有的mRNA寿命很短,只有1-2分钟,它们和结合的机会较少,因而就较不敏感。反之,另一些mRNA则很稳定,寿命可达十多分种,则其对相应的的抑制作用就很敏感。此外,本身的稳定性有很大的实际意义。显然,稳定的对靶mRNA的调节作用比不稳定的要好。
使分子稳定的方法如下:
[1]3'端带有茎环结构或类似ρ-不依赖性终止子结构时,可以稳定RNA分子。
[2]Gorski等还发现在T4噬菌体的基因32mRNA的5'端上游的茎环结构及其附近的序列亦可稳定RNA分子。所以在设计基因时,zui好将产生3'及5'端这种二级结构的序列克隆在基因的两端。Hirashima等1986年发现,针对靶mRNA的SD序列和AUG区域的,要比单纯对编码区域的更为有效。1989年Hirashima又发现,针对SD序列和它的上游区域(但不包括AUG)的更为有效。在真核生物中,针对5'端非编码区的更有效。但也有实验表明针对*内含子的也同样有效。
现在设计基因是时应注意之点总结如下:
[1]长的并不一定比短的更为有效。
[2]在原核生物中针对SD序列及其附近区域的可能更有效。
[3]在真核生物中,对应于5'端非编码区的可能比针对编码区的更有效。
[4]尽量避免在分子中出现自我互补的二级结构。
[5]设计的分子中不应有AUG或开放读框,否则该亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。
[6]进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在的3'端尾上,当与靶mRNA杂交后,即可利用其酶活性来降解靶mRNA。
此外,为了增强的作用,还可以采取一些额外措施,例如:[1]由于对靶mRNA的抑制作用有剂量依赖性,所以在构建基因时,要选择强的、可以诱导的启动子以增强本身的表达。[2]构建许多个基因串连在一起,以得到线性重复的多拷贝基因,对提高的表达也有利。[3]RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA杂交体,所以在构建基因时,可将RNA酶Ⅲ的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。这样,当与靶mRNA结合后,RNA酶Ⅲ即可将其降解。这显然有利于的抑制作用。
近年来,有关的研究进展迅速,已经应用到抗病毒感染,研究癌基因的作用机制,探索肿瘤治疗的可行途径等方面。在今后一段时间内,有关的研究肯定将会有更加迅速的进展和更广阔的应用前景。

-技术 
随着分子生物学和遗传工程的发展,基因治疗应运而生,反义技术是其中一种,它的基础是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸,从而抑制特定基因的表达,包括、反义DNA及核酶(Ribozyme),它们通过人工合成和生物合成获得。
(一),根据的作用机制可将其分为3类:Ⅰ类直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区,直接抑制翻译,或与靶mRNA结合形成双链RNA,从而易被RNA酶Ⅲ 降解;Ⅱ类与mRNA的非编码区结合,引起mRNA构象变化,抑制翻译;Ⅲ类则直接抑制靶mRNA的转录。 
(二)反义DNA是指一段能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合,并阻止其转录和翻译的短核酸片段,主要指反义寡核苷酸,因更具药用价值而倍受重视。
(三)核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA,主要参加RNA的加工与成熟。天然核酶可分为四类:(1)异体催化剪切型,如RNaseP;(2)自体催化的剪切型,如植物类病毒、拟病毒和卫星RNA;(3)*组内含子自我剪接型,如四膜虫大核26SrRNA;(4)第二组内含子自我剪接型。利用反义技术研制的药物称反义药物。反义药物作用于产生蛋白的基因,因此可广泛应用于多种疾病的治疗,如传染病、炎症、心血管疾病及肿瘤等。与传统药物比较反义药物更具选择性及效率,因此也更低毒。基于上述特点反义药物已成为药物研究和开发的热点。而且反义技术还可以应用于生物科学的基础研究。

 
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